25.04.2008, 01:22:51 - [Medizin] - Lukas Brausch
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In der Zellbiologie wird der Ausdruck DNA-Klonierung in zweifacher Hinsicht gebraucht.
Zum einem bezieht er sich im wörtlichen Sinne auf den Vorgang der Herstellung vieler identischer Kopien eines DNA-Moleküls, zum anderen wird er auch verwendet, um die Isolierung eines bestimmten DNA-Abschnitts (meist ein Gen) vom Rest der zellulären DNA zu beschreiben, da diese Isolierung durch die Herstellung vieler identischer Kopien eines bestimmten Gens erleichtert wird. Bereits vor einiger Zeit haben wir uns mit den Grundlagen der DNA-Klonierung » beschäftigt und wollen nun mit diesem Artikel einen etwas detaillierteren Einblick wagen.

DNA-Ligase verbindet DNA-Fragmente zu einem rekombinanten DNA-Molekül
Das Enzym DNA-Ligase verbindet die Brüche im DNA-Gerüst, die bei der DNA-Replikation und der DNA-Reparatur auftreten. Weil die DNA in allen Organismen die selbe chemische Struktur besitzt und die DNA-Ligase zwei beliebige DNA-Fragmente miteinander verbinden kann, wird das Enzym bei der Verbindung von DNA-Fragmenten aus verschiedenen Quellen eingesetzt.
Wenn eine solche Fremd-DNA in geeignetere Weise in die DNA der Wirtszelle eingefügt wird, wird sie repliziert und » transkribiert, als wäre sie normaler Bestandteil der zellulären DNA.

Bakterielle Plasmide werden zur Klonierung von DNA verwendet
Die einfachste Methode um einen DNA Abschnitt (wie zum Beispiel ein Gen) zu klonieren besteht darin die zu kopierende DNA in ein sich schnell teilendes Bakterium einzuführen. Um die Fremd-DNA in der Bakterienzelle stabil zu halten, wird ein bakterielles » Plasmid (bzw. die DNA eines Virus) als Vektor verwendet. Ein typischer Klonierungsvektor ist ein relativ kleines ringförmiges DNA-Molekül von mehreren tausend Nucelotidpaaren Länge, welches in der Bakterienzelle repliziert werden kann.
Ein Plasmidvektor muss einen Replikationsursprung (ori), damit die Replikation in der Bakterienzelle auch unabhängig vom bakteriellen Chromosom erfolgen kann und eine Schnittstelle für eine Restriktionsendonuclease, damit das Plasmid geöffnet und das fremde DNA-Fragment eingeführt werden kann, enthalten.
In den meisten Fällen enthält das Plasmid, das als Vektor dient, noch ein Gen für einen Selektionsmarker (zum Beispiel ein Antibiotikaresistenzgen), wodurch sich Bakterien, die das rekombinante Plasmid aufgenommen haben, identifizieren lassen.
Nachdem das gereinigte Plasmid mit einer Restriktionsendonuclease an genau einer Stelle geschnitten wurde, kann das gewünschte DNA-Fragment mit Hilfe von DNA-Ligase kovalent mit eben diesem verbunden werden.
Dieses neu entstandene rekombinante DNA-Molekül wird nun durch Transformation in ein Bakterium eingeschleust. Danach wird das Bakterium auf einem Nährboden kultiviert, wobei es sich ca. alle 30 Minuten verdoppelt und somit auch das neu hergestellte DNA-Molekül mit dupliziert.
Bereits nach einem Tag stehen mehrere Millionen Kopien des Plasmids im Labor zur Verfügung.
Um an das gewünschte Gen zu gelangen müssen die Bakterien lysiert (zerstört) werden und die kleinere Plasmid-DNA kann vom Rest der Zellkomponenten, einschließlich des größeren bakteriellen Chromosoms, abgetrennt werden.
Die gereinigte Plasmid-DNA enthält mehrere Millionen Kopien des ursprünglichen DNA-Fragments, das aus der Plasmid-DNA mit Hilfe meiner geeigneten Restriktionsendonuclease wieder ausgeschnitten und über die Methode der » Gelelektrophorese davon abgetrennt werden.

Menschliche Gene werden durch DNA-Klonierung isoliert
Wie wird ein einzelnes menschliches Gen erstmals durch Klonierung isoliert? Im folgenden dient das Blutgerinnungsprotein Faktor VIII. Der erste Schritt beim Umgang mit den 3x10^9 Nucleotidpaaren des kompletten Humangenoms stellt immer eine Fragmentierung der gesamten DNA dar. Dafür werden zum Beispiel Restriktionsendonucleasen benutzt, die die DNA zufällig in kleinere Fragmente zerlegen. Wenn nun jedes dieser Fragmente mit den oben beschriebenen Methoden kloniert wird, erhalten wir eine Genbank. Mittlerweile gibt es Genbanken von vielen verschiedenen Organismen, die jedem Wissenschaftler frei zur Verfügung stehen.

Das Gemisch der durch Restriktionsenzyme hergestellten DNA-Fragmente wird in Plasmidvektoren eingefügt. Diese rekombinanten Plasmide werden mit einer E.oli Kultur bei einer Konzentration, dass nur jeweils ein Plasmid von jedem Bakterium aufgenommen wird, vermischt.
Isoliert man nun Kolonien, die von einem einzigen Bakterium abstammen, so repräsentiert jede dieser einzelnen Kolonien einen Klon eines bestimmten DNA-Abschnitts.
Eine Sammlung von mehreren Millionen Kolonien in einer solchen Gendatenbank kann also das ganze Genom des Menschen beinhalten.

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